Fluorescencia molecular

Fundamentos científicos.

Teoría de la fluorescencia molecular

La fluorescencia es un proceso de emisión, en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética de la zona del espectro UV-visible. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. Una de las características más atractivas de los métodos de fluorescencia es su sensibilidad inherente, la cual es , con frecuencia, de uno a tres ordenes de magnitud mejor que las de la Espectrofotometría de absorción molecular. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los métodos de absorción debido al número relativamente limitado de sistemas químicos que se pueden hacer fluorescer.

Los electrones más externos de la molécula (en orbitales moleculares) son los responsables de la absorción y emisión de radiación en fluorescencia. El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no pueden haber dos electrones con los cuatro números cuánticos iguales, lo que significa que no deben haber más de dos electrones en un orbital, y que, además, deben tener los estados de espín opuestos: espines apareados. Debido al apareamiento de espines, la mayoría de las moléculas son diamagnéticas (no son atraídas ni repelidas por campos magnéticos permanentes). Por el contrario, las especies radicales libres, contienen electrones desapareados; es decir, son paramagnéticas (tienen un momento magnético y son atraídas cuando se encuentran en él).

En el estado fundamental, denominado singlete fundamental (s), todos los electrones se encuentran apareados. Cuando uno de los electrones es excitado por acción de un fotón a un nivel energético superior, se forma un estado singlete excitado (s*), en el cual el espín del electrón excitado continúa apareado con el electrón del estado fundamental. En algunos casos, el electrón excitado cambia el espín y queda desapareado con el electrón del estado fundamental. En este caso se forma un esta triplete excitado (t*).

Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque hay diversas formas en las cuales un átomo o una molécula excitada liberan su exceso de energía y se relajan a su estado fundamental. Dos de las más importantes de estos mecanismos son la relajación o desactivación no radiante (con pérdida de calor) y la relajación radiante (con pérdida de fotones).

En los mecanismos de relajación no radiante, los electrones excitados pueden “bajan” a través de los niveles vibracionales del orbital, por ello se denomina relajación vibracional. En solución, el exceso de energía vibracional se pierde rápidamente por colisiones de las moléculas excitadas y el solvente, resultando en un aumento de temperatura. La relajación no radiante puede ocurrir a través de un proceso de conversión externa o interna.

• Se denomina conversión externa cuando el estado electrónico excitado se desactiva por interacción y transferencia de energía a moléculas del solvente u otros solutos (colisiones). La evidencia de esta conversión es el marcado efecto del solvente sobre la intensidad de fluorescencia de una sustancia. La conversión externa se ve favorecida con las condiciones que aumentan el número de colisiones: elevada temperatura del medio y baja viscosidad del solvente.

• Se denomina conversión interna en moléculas que tienen los niveles de energía electrónica muy próximos entre sí, dando lugar al solapamiento de los niveles de energía vibracional, y a la consecuente pérdida del exceso de energía en forma de calor.

Los mecanismos de relajación radiante pueden ser fluorescencia o fosforescencia. La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las transiciones electrónicas responsables de la fluorescencia no se acompañan de cambios en el espín del electrón (singlete*→singlete), presentando una vida muy corta, perdiendo la luminiscencia casi inmediatamente. Las emisiones de fosforescencia están acompañadas de cambios en el espín del electrón (triplete*→singlete), manteniéndose durante más tiempo la radiación, después de haber acabado la irradiación. El proceso en el que el espín del electrón excitado (s*) se invierte quedando en estado triplete* (s*→t*) se denomina cruzamiento de sistemas.

En el proceso fluorescente, algo del exceso de energía de radiación que se pierde en forma de calor (proceso no radiante) y la energía restante se pierde por emisión de un fotón. Por consiguiente, la energía de los fotones emitidos será menor que la energía de los fotones absorbidos, y ya que la energía es proporcional a la frecuencia, la frecuencia de la radiación emitida será menor que la de la radiación absorbida. Si la frecuencia de la radiación emitida es menor que la de la radiación absorbida, entonces la radiación fluorescente debe tener mayor longitud de onda que la de la radiación que se absorbió originalmente. Este fenómeno se conoce con el nombre de desplazamiento de Stokes.

Variables que afectan a la fluorescencia

Rendimiento cuántico: El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia es simplemente las relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al número total de moléculas excitadas. Las moléculas altamente fluorescentes, por ejemplo, la fluoresceina, tienen eficiencias cuánticas que, en ciertas condiciones, se aproximan a la unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prácticamente cero.

Estructura química: La fluorescencia más intensa y útil es la que presentan compuestos con grupos funcionales aromáticos. La mayoría de los hidrocarburos aromáticos son fluorescentes en solución y la eficiencia cuántica aumenta con el número de anillos y con el grado de condensación. La sustitución con halógenos disminuye la fluorescencia debido al aumento del nº atómico por efecto de átomo pesado (produce cruzamiento de sistemas y fosforescencia). La adición de un ácido carboxílico o grupo carbonilo en un anillo aromático generalmente inhibe la fluorescencia.

Rigidez estructural: Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está particularmente favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas. Por ejemplo, las eficacias cuánticas para el fluoreno (1,0) y bifenilo (0,2) son diferentes a pesar de presentar una estructura química similar. El resultado de esta diferencia parecería ser el aumento de rigidez proporcionado por el puente que forma el grupo metileno en el fluoreno.

Temperatura: El aumento de temperatura aumenta la frecuencia de las colisiones entre las moléculas y, por lo tanto, la desactivación por conversión externa (relajación no radiante).

Viscosidad del solvente: La disminución en la viscosidad del medio lleva a un aumento en la frecuencia de las colisiones intermoleculares, desactivación por conversión externa (relajación no radiante).

pH: La fluorescencia de compuestos aromáticos con sustituyentes ácidos o básicos depende del pH (las formas ionizada y asociada tienen diferentes absortividades e intensidades de emisión). La influencia del pH en ciertos compuestos se ha utilizado para la detección de puntos finales en las valoraciones ácido/base.

Oxígeno disuelto: el oxígeno disuelto disminuye la intensidad de fluorescencia porque ocurre una atenuación (quenching) como consecuencia de las propiedades paramagnéticas del oxígeno molecular que provoca el cruce de sistemas y las conversiones al estado triplete, y, por lo tanto, emisión de fosforescencia.

Concentración: La intensidad de la fluorescencia (PF) es proporcional a la cantidad de fotones provenientes de la fuente que son absorbidos y del rendimiento cuántico.

PF = K x C

Esa ecuación se cumple a concentraciones bajas (A < 0,05). Cuando la concentración es alta se producen dos fenómenos adicionales, responsables de desviaciones negativas de la linealidad: autoabsorción (absorción por moléculas vecinas de la radiación emitida. Tiene lugar cuando la longitud de onda de emisión se solapa con un pico de absorción) y autoapagamiento (resultado de la conversión externa por colisiones entre las moléculas cercanas).

Espectrofluorómetro

El fluorómetro consta de una fuente de luz que produce luz blanca (policromática). Este rayo pasa a través de un primer monocromador (monocromador de excitación). El rayo monocromático que atraviesa la muestra donde se produce la fluorescencia. A 90° hay un segundo monocromador (monocromador de emisión), que selecciona la longitud de onda de los fotones emitidos por la muestra. Los fotones emitidos inciden sobre el detector que es un fotomultiplicador.

Ajustes de escala

Los extremos de la escala de un espectrofluorómetro son PF = 0, que indica que no se emite radiación fluorescente y, por lo tanto, no llega luz al detector; y PF = 100, que indica la mayor potencia fluorescente que llega al detector (figura 3.7). Por lo anterior, para ajustar PF = 0 se usa solvente o blanco (no presenta fluorescencia), mientras que PF = 100, con la potencia fluorescente de la solución más concentrada. Cabe aclarar que se trata de una escala lineal “relativa”, donde arbitrariamente se usa la solución más concentrada para ajusta el 100 de la escala.

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