Cromatografía

Fundamentos teóricos y metodológicos

Cromatografía

La cromatografía agrupa un conjunto de métodos que facilitan la separación, identificación y determinación de componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas. En todas las separaciones cromatográficas la muestra se disuelve con una fase móvil (FM, que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico), la cual se hace pasar a través de una fase estacionaria (FE) inmiscible fija en una columna o en una superficie sólida.

Las dos fases se eligen de tal forma que los distintos componentes de la muestra se distribuyen en grados distintos entre la fase móvil y la fase estacionaria, lo que produce diferentes velocidades de elución en los distintos componentes. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la FE se mueven más lentamente, mientras que los componentes unidos débilmente a la FE (más afines a la FM) se mueven con mayor rapidez. Como consecuencia de las diferentes velocidades de migración, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas distintas que se pueden analizar de forma separada y cuantitativa.

Cromatograma

Si al final de la columna se coloca un detector que responda a la concentración de soluto y se registra su señal en función del tiempo, se obtiene una serie de picos. Este gráfico se denomina cromatograma, y es útil tanto para análisis cualitativos como cuantitativos. La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para la identificación de los componentes de la muestra (tiempo de retención), mientras que las áreas de los picos proporcionan una medida cuantitativa de las cantidades de cada componente.

Teoría de platos en cromatografía

La teoría de platos se basa en considerar que la columna cromatográfica es como si estuviera constituida por numerosas, pero discretas capas estrechas, denominadas platos teóricos, en términos análogos a lo que ocurre en la teoría de la destilación fraccionada. Se considera que en cada plato se establece un equilibrio del componente entre la fase móvil y la fase estacionaria, y el desplazamiento del analito a través de la columna se trata como una transferencia de la fase móvil desde un plato al siguiente. La eficacia de la columna aumenta al hacerlo el número de estas transferencias, esto es, al aumentar el número de platos teóricos.

El número de platos teóricos de una columna se relaciona con la eficacia o eficiencia de la elución cromatográfica. La observación de los picos cromatográficos muestra una gran semejanza con las curvas de error normal o Gaussianas. El tiempo de residencia en una fase dada es muy irregular, pudiendo ser muy pequeño en algunas etapas, y relativamente grande en otras. Por ello, el tiempo de permanencia de la partícula en el interior de la columna también será irregular, ya que solamente se eluye cuando reside en la fase móvil. Debido a que los procesos individuales mencionados transcurren de forma aleatoria, se obtiene una dispersión de los tiempos de residencia en la columna (o de las velocidades).

El ensanchamiento de los picos de los distintos componentes del analito actúa en detrimento de la separación, de forma que el objetivo en cromatografía es la obtención de picos estrechos y simétricos. El término eficacia, se utiliza para describir el ensanchamiento de las bandas de los solutos en su movimiento a través de la columna, papel o placa. Así, a mayor dispersión de los tiempos de residencia, más anchos serán los picos y, por lo tanto, menor será la eficacia de la elución.

Por otro lado, los picos simétricos (Gaussianos) se originan cuando el coeficiente de distribución es constante e independiente de la cantidad de soluto. En realidad, casi siempre se obtienen picos asimétricos, ya que el cociente de la concentración de soluto entre la FE y la FM suele variar con la cantidad de soluto.

La teoría de platos explica satisfactoriamente la forma de los picos cromatográficos, si bien, falla al intentar justificar el ensanchamiento de los mismos. Por otra parte, se basa en unas supuestas condiciones de equilibrio que, en realidad no se alcanzan, debido al movimiento continuo de la fase móvil.

Teoría cinética en cromatografía

La teoría cinética considera que el ensanchamiento de las bandas (o picos) cromatográficos se produce como consecuencia de que los distintos procesos de transferencia de masa durante el desplazamiento de una especie a lo largo de la columna ocurren a velocidad finita. Según esta teoría, la forma de los picos depende de los siguientes factores:

Difusión por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase móvil.
Difusión longitudinal del soluto a lo largo de la columna.
Equilibrio del soluto entre las fases móvil y estacionaria no suficientemente rápido.

Los tres factores mencionados normalmente se relacionan en la ecuación de Van Deemter.

Resolución cromatográfica

Se denomina resolución cromatográfica (Rs) al grado de separación de los picos en un cromatograma con respecto a sus anchos.

Tipos de cromatografía según la fase móvil

1. Cromatografía de líquidos:

Lo que define al tipo de cromatografía es la FM. Cuando es un líquido, la cromatografia es de líquidos, mientras que cuando es un gas, es de gases. En la cromatografía de líquidos la FE puede ser un sólido (separación por adsorción en la FE y solubilidad en la FM) o un líquido (separación por solubilidad en ambas fases). La cromatografía de líquidos instrumental recibe el nombre de HPLC (high performance liquid chromatography o high pressure liquid chromatography). La HPLC puede ser en fase normal o en fase reversa. La cromatografía de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos sobre la base de su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. Por otro lado, la cromatografía en fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada.

2. Cromatografía de gases:

La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de un mechero de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interactúa con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna. La FE puede ser sólida (separación por adsorción y volatilidad) o líquida (separación por solubilidad y volatilidad).

Aspectos metodológicos y aplicaciones

La cromatografía se puede utilizar con fines cuali o cuantitativos. El tiempo de retención es la variable aplicada para el análisis cualitativo, mientras que el área o altura del pico es la variable utilizada para el análisis cuantitativo. Las aplicaciones cuali y cuantitativas de la cromatografía en columna se basan en la comparación con los correspondientes a los patrones.