Fundamentos científicos.
Espectrofotometría de absorción en la región UV-Visible del espectro electromagnético
En esta técnica instrumental se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la región del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición de los electrones de los orbitales moleculares de la molécula del analito hacia un estado excitado, por lo cual se transmite un haz de menor potencia o intensidad radiante. En esta técnica se mide la cantidad de fotones absorbidos que depende de longitud de onda, de la longitud del paso óptico, de la estructura de las moléculas y de su concentración en la muestra (Ley de Lambert-Beer).
La absorción de radiación ultravioleta o visible es el resultado del estímulo de los fotones sobre la muestra de moléculas que produce la excitación de los electrones de enlace. Los electrones que contribuyen a la absorción son de dos tipos: enlazantes (orbitales sigma o pi) y no enlazantes (orbitales n). Al absorber energía, los electrones pasan de un estado enlazante o no enlazante a uno antienlazante (estado excitado).
Los compuestos sólo absorben radiación a longitudes de onda específicas, y es lo que causa su color. Si el compuesto es colorido, habrá al menos una, o hasta varias longitudes de onda distintas, que tienen absorbancias máximas. Una gráfica de absorbancia en función de la longitud de onda se denomina espectro UV-visible o curva espectral UV-visible. La mayoría de los espectrofotómetros UV-visible permiten explorar un intervalo de longitud de onda.
Para analizar una sustancia con esta técnica analítica, es necesario seleccionar primero la longitud de onda de trabajo. En general se elije la longitud de onda de máxima absorción para garantizar buenos niveles de sensibilidad y límites de detección. Además, nunca se eligen pendientes porque provocan desviaciones instrumentales a la ley de Lambert-Beer.
En esta técnica instrumental, una celda o cubeta transparente sencilla, contiene la muestra de moléculas absorbentes, por donde pasa un haz de luz monocromático. La potencia[1] incidente del haz (Po) disminuye luego de atravesar la muestra porque algunos de los fotones son absorbidos por las moléculas de la muestra y, en consecuencia, de la celda sale un haz de luz de menor potencia (P).
[1] La potencia radiante (P) representa la cantidad de fotones transmitida en forma de radiación electromagnética por unidad de tiempo.
La magnitud de la absorción de la especie molecular involucrada depende de su concentración molar (C), de la longitud del paso óptico (b), que es normalmente de 1 cm, y de la absortividad molar de la especie absorbente, que depende de la naturaleza de la molécula absorbente y de la longitud de onda (ley de Lambert-Beer):
A = a * b * C
Espectrofotómetro
El espectrofotómetro consta de una fuente de luz que produce luz blanca (policromática). La primera rendija selecciona un rayo que contiene todas las frecuencias emintidas. Este rayo pasa a través de un monocromador (por ejemplo un prisma de vidrio o una red de difracción) que descompone la luz blanca en sus diferentes frecuencias (del rojo al violeta cuando es REM visible). Una segunda rendija selecciona una de las frecuencias (luz monocromática) que incidirá sobre la cubeta que contiene la muestra. Al conjunto del selector de longitud de onda (prisma o red de difracción) y segunda rendija se la denomina monocromador. El rayo monocromático que atraviesa la muestra incide sobre el detector, que transfiere los datos a un sistema informático donde se genera el espectro de absorción o curva espectral. Si la frecuencia seleccionada en la segunda rendija no es absorbida por la muestra se produce un punto de la línea base del espectro. Cuando la frecuencia de la radiación es adecuada para producir una transición (electrónica) se observa un pico de absorción en el espectro.
Existe un tipo de espectrofotómetros denominados de óptica inversa o de arreglo de diodos, en los cuales a la muestra llega radiación policromática (con todas las longitudes de onda), las moléculas absorben algunas de las longitudes de onda características. La luz transmitida pasa a través de una rendija a una rejilla de dispersión, desde donde el arco iris se dirije a una matriz unidimensional de arreglo de diodos.
Ajustes de escala
La señal en espectrofotometría es lineal en unidades de transmitancia y logarítmica en unidades de absorbancia. Los extremos de la escala de un espectrofotómetro son T = 0 % (se corresponde con A = infinito), que indica que no se transmite luz y, por lo tanto, no llega luz al detector; y T = 100 % (se corresponde con A = 0), que indica que se transmite toda la luz, y, por lo tanto, la potencia de luz que llega al detector es Po. El 0 % T se ajusta con un oburador de luz, y el 100 % con solvente o blanco.
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